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reads千萬條,接頭

更新時(shí)間:2022-09-21  |  點(diǎn)擊率:822

轉(zhuǎn)自羅氏診斷生命科學(xué)公眾號(hào)

接頭連接是二代測序文庫制備的重要環(huán)節(jié),接頭連接效率是影響文庫質(zhì)量和產(chǎn)量的重要指標(biāo)之一,它直接影響文庫的多樣性以及低頻突變檢測的準(zhǔn)確性。隨著測序儀的不斷迭代,接頭設(shè)計(jì)也在不斷升級(jí),種類更加多樣化。

接頭結(jié)構(gòu)

接頭作為文庫的組成部分,以illumina接頭為例,一般包括P5/P7、Index以及R1 SP/R2 SP序列,長約60bp左右(不同種類的接頭長度有所不同)。其中P5/P7序列與測序芯片上的P5/P7序列互補(bǔ),通過錨定將待測片段固定在flow cells上進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增;Index又稱為樣本標(biāo)簽,目的是給文庫加上特定的標(biāo)簽,用于文庫混合測序時(shí)區(qū)分不同的文庫樣本;R1 SP/R2 SPRead1Read2測序引物結(jié)合的區(qū)域,在dNTPDNA聚合酶的作用下進(jìn)行堿基延伸。下圖是接頭的一般結(jié)構(gòu),呈“Y"字型。

接頭種類

羅氏測序樣本制備解決方案提供兼容illumina儀器的全套KAPA接頭產(chǎn)品組合(2),按照接頭連接方式分為全長接頭和截短接頭。



全長接頭

KAPA UDI Adapters是一種由P5/P796種雙端Index以及R1 SP/R2 SP序列組成的全長接頭,適用于PCR-free文庫制備流程。


截短接頭

截短接頭僅包括R1 SP/R2 SP序列,P5/P7Index序列需通過引物擴(kuò)增連入接頭。KAPA HyperPlex Adapters是一套完整的接頭組合產(chǎn)品:

KAPA Universal Adapter截短型雙端通用接頭,適用于非低頻突變檢測

KAPA Universal UMI Adapter帶有UMIUnique Molecular Identifiers)的截短型雙端通用接頭,適用于低頻突變檢測

KAPA UDI Primer Mixes 1-384搭配兩種KAPA通用短接頭使用,實(shí)現(xiàn)達(dá)384Index組合的高通量混樣測序

接頭攻略

雙端標(biāo)簽設(shè)計(jì),有效剔除標(biāo)簽

錯(cuò)配序列

多重混樣測序時(shí),有時(shí)會(huì)發(fā)生接頭標(biāo)簽序列錯(cuò)配的問題,進(jìn)而導(dǎo)致測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的下降和結(jié)果可信度的降低。錯(cuò)配的風(fēng)險(xiǎn)主要由以下原因引發(fā):

1)測序儀工作時(shí)發(fā)生的標(biāo)簽跳躍/轉(zhuǎn)換現(xiàn)象

2)標(biāo)簽試劑或者樣品間的交叉污染

3)混合樣品在PCR擴(kuò)增時(shí)發(fā)生模板調(diào)換

4)測序或數(shù)據(jù)分析錯(cuò)誤

KAPA UDI接頭雙端標(biāo)簽組合在數(shù)據(jù)分析之前即可過濾掉因標(biāo)簽錯(cuò)配而產(chǎn)生的錯(cuò)誤序列,從而提升變異識(shí)別準(zhǔn)確性。

UMI標(biāo)簽設(shè)計(jì),提高低頻突變檢測準(zhǔn)確性


低頻突變檢測在腫瘤研究,特別是液體活檢研究方面至關(guān)重要,但在文庫構(gòu)建、靶向富集和測序過程中引入的突變會(huì)阻礙低頻變異檢測的準(zhǔn)確性,UMI標(biāo)簽可以對(duì)原始樣本進(jìn)行分子標(biāo)記,有利于后續(xù)在數(shù)據(jù)分析時(shí)對(duì)原始樣本進(jìn)行追蹤和分組,從而對(duì)假陽性突變進(jìn)行校正。

KAPA Universal UMI Adapter采用羅氏專有設(shè)計(jì),可防止因UMI序列發(fā)生錯(cuò)誤導(dǎo)致樣本追蹤錯(cuò)誤,在性能上表現(xiàn)出更高的雙鏈回收率和更低的錯(cuò)誤率。


截短型KAPA HyperPlex接頭可以獲得

更高的文庫產(chǎn)量


KAPA HyperPlex接頭擴(kuò)增效率高,文庫轉(zhuǎn)化率高,可以在較少的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)下得到較高的文庫產(chǎn)量,其文庫產(chǎn)量幾乎是全長接頭的兩倍。

滿足實(shí)驗(yàn)所需文庫產(chǎn)量的情況下,較少的擴(kuò)增循環(huán)可以增加文庫多樣性并減少PCR重復(fù)序列。


高質(zhì)量二代測序數(shù)據(jù)少不了接頭助力,

接頭怎么選你學(xué)會(huì)了嗎?




MC-CN-02167 有效期至2025年5月18日。



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